Giardia duodenum በተለይ በትናንሽ ሕፃናት ላይ የተቅማጥ ክሊኒካዊ ምልክቶች ባጋጠማቸው የአንጀት ኢንፌክሽን በተለይም ጃርዲያሲስን የሚያመጣ ጥገኛ ተውሳክ አካል ነው።ኤክስትራሴሉላር ጂ duodenalis ኢንትራሴሉላር ኦሊጎሜራይዜሽን መሰል ተቀባይ 3 (NLRP3) ትስስር ኑክሊዮታይድ እንዲነቃ እንደሚያደርግ እና የአስተናጋጁ እብጠት ምላሽን በ extracellular vesicle (EV) secretion እንደሚቆጣጠር ከዚህ ቀደም ዘግበናል።ይሁን እንጂ በዚህ ሂደት ውስጥ የተሳተፈው በሽታ አምጪ-ተዛማች duodenococcal EV (GEV) ትክክለኛ ሞለኪውላዊ ቅጦች እና የ NLRP3 ኢንፍላማሶም በጃርዲያሲስ ውስጥ ያለው ሚና ሊገለጽ ይችላል።
Recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+) -alpha-2 እና alpha-7.3 giardins በ GEV ውስጥ ተገንብተው ወደ መዳፊት የመጀመሪያ ደረጃ ፐርቶናል ማክሮፋጅስ ተለውጠዋል እና እብጠትን ኢላማ ሞለኪውል ካስፓዝ-1 በመለካት ተገኝተዋል።የ p20 አገላለጽ ደረጃ ተጣርቷል..G. duodenalis alpha-2 እና alpha-7.3 giardines በመጀመሪያ በ NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 እና caspase-1 p20), IL secretion በመለካት ተለይተዋል.1β ደረጃዎች፣ አፖፖቲክ ስፖትድድድ ፕሮቲን (ASC) ኦሊጎሜራይዜሽን ደረጃዎች፣ እና የNLRP3 እና ASC የ immunofluorescent አካባቢያዊነት።የ NLRP3 ኢንፍላማሶም በጂ duodenalis በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ውስጥ ያለው ሚና NLRP3 ማግበር የታገደበት (NLRP3 የታገዱ አይጦች) እና በሰውነት ክብደት ላይ የበሽታ ለውጦች ፣ duodenal parasitic load እና duodenal ቲሹ ቁጥጥር የተደረገባቸው አይጦችን በመጠቀም ተገምግሟል።በተጨማሪም ፣ hiaardines alpha-2 እና alpha-7.3 IL-1β secretion in vivo በ NLRP3 inflammasome በኩል ማነሳሳቱን መርምረናል እና የእነዚህ ሞለኪውሎች ሚና በጂ duodenalis አይጥ ውስጥ ያለውን በሽታ አምጪነት ወስነናል።
አልፋ-2 እና አልፋ-7.3 ጃርዲኖች የ NLRP3 ኢንፍላማሶም በብልቃጥ ውስጥ እንዲነቃቁ ያነሳሳሉ።ይህ የ p20 caspase-1 ገቢር ሆኗል, የ NLRP3, ፕሮ-IL-1β እና ፕሮ-ካሳሴ-1 ፕሮቲኖች የመግለጫ ደረጃዎች መጨመር, በ IL-1β ውስጥ ከፍተኛ መጠን ያለው ፈሳሽ መጨመር, በ ውስጥ የኤኤስኤ ቦታዎች መፈጠርን አስከትሏል. ሳይቶፕላዝም, እና ASA oligomerization መነሳሳት.NLRP3 ብግነት የወንድ ብልት ማጣት የጂ.በNLRP3 የታገዱ አይጦች በሳይስቲክ የታከሙ አይጦች የትሮፖዞይተስ ብዛት ጨምሯል እና በ duodenal villi ላይ ከባድ ጉዳት ያደርሳሉ ፣ይህም በኒክሮቲክ ክሪፕቶች የተጨማደዱ እና ቅርንጫፎቹ ተለይተው ይታወቃሉ።በ Vivo ሙከራዎች እንደሚያሳዩት giardines alpha-2 እና alpha-7.3 IL-1β በ NLRP3 ኢንፍላማሶም በኩል እንዲፈጠር ሊያደርግ ይችላል እና በጃርዲን አልፋ-2 እና አልፋ-7.3 ክትባቱ የጂ duodenalis አይጦችን በሽታ አምጪነት ይቀንሳል።
የዚህ ጥናት ውጤት አንድ ላይ ሲደመር giardia alpha-2 እና alpha-7.3 አስተናጋጁ NLRP3 እብጠት እንዲስተካከል እና የጂ ዱዮዲናሊስ አይጦችን ኢንፌክሽኖች ይቀንሳሉ ፣ይህም ጃርዲያሲስን ለመከላከል ተስፋ ሰጪ ናቸው።
Giardia duodenum በትናንሽ አንጀት ውስጥ የሚኖር ከሴሉላር ውጭ የሆነ ፕሮቶዞአን ጥገኛ ተውሳክ ሲሆን በዓመት 280 ሚሊዮን የጃርድዲያስ በሽታዎችን በተቅማጥ በሽታ ያስከትላል በተለይም በማደግ ላይ ባሉ ታዳጊ ህጻናት [1]።ሰዎች በመጠጥ ውሃ ወይም በ M. duodenum cysts የተበከለ ምግብ ይያዛሉ, ከዚያም ወደ ሆድ ውስጥ ይገባሉ እና በጨጓራ ጭማቂ ውስጥ ይወጣሉ.Giardia duodenum trophozoites ከ duodenal epithelium ጋር በማያያዝ ማቅለሽለሽ ፣ ማስታወክ ፣ ተቅማጥ ፣ የሆድ ህመም እና ክብደት መቀነስ ያስከትላል።የበሽታ መከላከያ እጥረት እና ሳይስቲክ ፋይብሮሲስ ያለባቸው ግለሰቦች ለበሽታ ይጋለጣሉ.ኢንፌክሽን በአፍ እና በፊንጢጣ ወሲብ ሊከሰት ይችላል [2].እንደ metronidazole, tinidazole እና nitazoxanide ያሉ መድኃኒቶች ለ duodenal ኢንፌክሽን ተመራጭ የሕክምና አማራጮች ናቸው [3].ይሁን እንጂ እነዚህ የኬሞቴራፒ መድሃኒቶች እንደ ማቅለሽለሽ, ካርሲኖጅጄኔሲስ እና ጂኖቶክሲክቲስ [4] የመሳሰሉ የጎንዮሽ ጉዳቶችን ያስከትላሉ.ስለዚህ, G. duodenalis ኢንፌክሽንን ለመከላከል የበለጠ ውጤታማ ስልቶችን ማዘጋጀት ያስፈልጋል.
ኢንፍላማሶም የሳይቶሶሊክ ፕሮቲን ውስብስቦች ክፍል ሲሆን በተፈጥሮ በሽታ የመከላከል ምላሽ አካል የሆኑ፣ በሽታ አምጪ ወረራዎችን ለመከላከል እና እብጠት ምላሾችን በማስታረቅ [5]።ከነዚህ ኢንፍላማሶሞች መካከል ኑክሊዮታይድ-ቢንዲንግ ኦሊጎሜራይዜሽን (NOD) ተቀባይ 3 (NLRP3) ኑክሊዮታይድ-ቢንዲንግ ኦሊጎሜራይዜሽን (NLRP3) ኑክሊዮታይድ-ቢንዲንግ-እንደ ኢንፍላማሶም በተለያዩ በሽታ አምጪ/ጉዳት-ተያይዘው ሞለኪውላዊ ቅጦች (PAMP/) ስለሚታወቅ በሰፊው ጥናት ተደርጓል። DAMP) ይገነዘባል, የተፈጥሮን በሽታ የመከላከል ስርዓትን ያንቀሳቅሰዋል.እና የአንጀት homeostasisን በብዙ የአመፅ በሽታዎች ይቆጣጠራል [6,7,8].የስርዓተ-ጥለት ማወቂያ ተቀባይ (PRR) NLRP3፣ አስማሚ አፖፖቲክ ስፖትድድ ፕሮቲን (ASC) እና ተፅዕኖ ፈጣሪ ፕሮካሳፓስ-1 ወይም ፕሮካሳፓስ-11ን ያካትታል።የ NLRP3 ኢንፍላማሶም በሽታ አምጪ ወረራ ላይ እንደ አስተናጋጅ ሆኖ ያገለግላል፣ በኒዮፖራ ካንየም [9]፣ Paracoccidioides brasiliensis [10] እና Leishmania ጥናቶች ላይ እንደታየው።[11]፣ ነገር ግን የ NLRP3 ኢንፍላማሶም ማግበር የመከላከያ የመከላከያ ምላሾችን እንደሚገድብ እና የበሽታ መሻሻልን እንደሚያባብስ ተዘግቧል፣ ለምሳሌ በትል [12]።በቀደሙት ግኝቶቻችን መሰረት፣ extracellular G. duodenalis የ NLRP3 እብጠትን በሴሉላር ውስጥ ማግበር እንደሚያስጀምር እና ከሴሉላር ቬሴሴል ውጭ የሆኑ ቬሴሴሎች (EVs) [13] በመደበቅ የህመም ማስታገሻ ምላሾችን እንደሚያስተካክል ዘግበናል።ነገር ግን በጂ ዱዮዲናሊስ ኢንፌክሽኑ ውስጥ የ NLRP3 ኢንፍላማሶም ሚና በ Vivo ውስጥ ሊታወቅ ይችላል.
Giardins በመጀመሪያ የ G. duodenalis cytoskeleton መዋቅራዊ አካላት ተብለው ተገልጸዋል እና በ trophozoite እንቅስቃሴ እና በትናንሽ አንጀት ውስጥ ኤፒተልየል ሴል ትስስር ውስጥ ትልቅ ሚና ይጫወታሉ።ከአካባቢው ሁኔታ ጋር በተሻለ ሁኔታ ለመላመድ እና በሽታ አምጪ ተህዋስያንን ለመጨመር ጂ. duodenalis trophozoites 8 ፍላጀላ ፣ 1 መካከለኛ አካል እና 1 ventral disc [14] ያቀፈ ልዩ የሳይቶስክሌትታል መዋቅር ፈጠሩ።የጃርዲያ ዶኦዲነም ትሮፖዞይቶች ሳይቶስኬልተናቸውን ተጠቅመው ወደ ላይኛው ትንሽ አንጀት በተለይም ዱኦዲነም ውስጥ ዘልቀው በመግባት ከኢንትሮይተስ ጋር ይያያዛሉ።የሴል ሜታቦሊዝምን በመጠቀም ያለማቋረጥ ይፈልሳሉ እና ወደ ኤፒተልየል ሴሎች ይጣበቃሉ.ስለዚህ, በሳይቶስክሌት እና በቫይረቴሽን መካከል የቅርብ ግንኙነት አለ.ለጃርዲያ ዶኦዲነም ልዩ የሆኑት የጃርዲን መድኃኒቶች የሳይቶስkeleton መዋቅር አካላት ናቸው [15] እና በአራት ክፍሎች የተከፋፈሉ፡ α-፣ β-፣ γ- እና δ-giardines።የ α-giardin ቤተሰብ 21 አባላት አሉ፣ ሁሉም በካልሲየም ላይ የተመሰረተ phospholipids [16] የማሰር ችሎታ አላቸው።በተጨማሪም ሳይቶስክሌትቶን ከሴል ሽፋን ጋር ያገናኛሉ.በ G. duodenalis ምክንያት ተቅማጥ ባለባቸው ግለሰቦች, α-giardins በከፍተኛ ሁኔታ ይገለጻሉ እና በበሽታ ጊዜ የበሽታ መከላከያ (immunoreactive) ናቸው [17].በጃርዲያ አልፋ-1 ላይ የተመሰረቱ ሄትሮሎጂካል ክትባቶች በአይጦች ላይ ከሚገኝ ጃርዲያሲስ የተጠበቁ እና ለክትባት ልማት እጩ አንቲጂኖች ናቸው [18]።በፕላዝማ ሽፋን እና በፍላጀላ ውስጥ የተተረጎመ, ነገር ግን በ ventral ዲስክ ውስጥ ሳይሆን, በ G. duodenalis [19] ውስጥ የትሮፖዞይተስ እንቅስቃሴን እና የእድገት ፍጥነትን ያሻሽላል Alpha-8 giardin.አልፋ-14 ጃርዲን በፍላጀላ ላይ ከሚገኙት ማይክሮቱቡል አወቃቀሮች ጋር ተያይዟል እና የ G. duodenalis መኖርን ይጎዳል።አልፋ-11 ጃርዲን በህይወት ዑደቱ ውስጥ በብዛት ይገኛል፣ እና አልፋ-11 ጃርዲን ከመጠን በላይ መገለጽ ጂ ዱዮዲናሊስን እራሱን ይጎዳል።ነገር ግን፣ alpha-2 giardine እና alpha-7.3 giardine ከጂ duodenalis ኢንፌክሽን እና ከስር ስርአታቸው የሚከላከሉ ስለመሆናቸው ግልፅ አይደለም።
በዚህ ጥናት፣ recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+) -alpha-2 giardine እና pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine አስተናጋጅ NLRP3ን ለማንቃት ወደ መዳፊት የመጀመሪያ ደረጃ ፐርቶናል ማክሮፋጅ ተለውጠዋል።ከዚያም የሚያቃጥሉ ኢላማዎች ተጣርተዋል.እኛ ደግሞ G. duodenalis ያለውን pathogenicity ውስጥ NLRP3 inflammasome ሚና ገምግሟል, alpha-2 እና alpha-7,3 giardines Vivo ውስጥ NLRP3 inflammasome ማግበር ማነሳሳት እንደሆነ መርምረናል, እና እነዚህ ሁለት ሚናዎች Giardines pathogenicity ውስጥ G. duodenalis.የጋራ ግባችን G. duodenalis ኢንፌክሽንን ለመከላከል ተስፋ ሰጪ ኢላማዎችን ማዘጋጀት ነበር።
የዱር ዓይነት (WT) C57BL/6 ሴት አይጦች ከ5-8 ሳምንታት የተገዙት ከሊያኦንግ ቻንግሼንግ የሙከራ የእንስሳት ማዕከል (ሊያኦኒንግ፣ ቻይና) ነው።አይጦች ውሃ በነፃ ማግኘት ችለዋል፣ የጸዳ ምግብ ተቀብለዋል እና በ12/12 ሰዓት ብርሃን/ጨለማ ዑደት ውስጥ ተጠብቀዋል።ኢንፌክሽኑ ከመያዙ በፊት አይጦች በአሚሲሊን (1 mg/mL) ፣ ቫንኮሚሲን (1 mg/ml) እና ኒኦማይሲን (1.4 mg/mL) በተጨመረ የመጠጥ ውሃ ውስጥ አንቲባዮቲክ ማስታወቂያ ሊቢቲም ወስደዋል (ሁሉም ከሻንጋይ ፣ ቻይና ፣ አርቲፊሻል ኦርጋኒክ የተገዙ) [22] ].].ለ> 24 ሰአታት የመመገብ እና የመጠጣት አቅሙን ያጡ እና ≥ 20% የሰውነት ክብደት የቀነሱ አይጦች በማህፀን በር መሰንጠቅ ሰብአዊነት ተሟጥጠዋል።
WB G. duodenalis trophozoites (የአሜሪካ ዓይነት የባህል ስብስብ፣ ምናሴ፣ ዩኤስኤ) በ12.5% ​​የፅንስ ቦቪን ሴረም (ኤፍ.ቢ.ኤስ፤ እያንዳንዱ አረንጓዴ፣ ዢጂያንግ፣ ቻይና) እና 0.1% የከብት እጢ (ሲግማ-አልድሪች፣ ሴንት ሚዙሪ፣ አሜሪካ) ተጨምረዋል። ).ዩኤስኤ) በማይክሮኤሮቢክ ሁኔታዎች ውስጥ.የተዋሃዱ ትሮፖዞይቶች በበረዶ ላይ ተሰብስበው በ 1: 4 ጥምርታ ለበለጠ መራባት ተላልፈዋል.
ቀደም ሲል እንደተገለፀው የጃርዲያ duodenum cysts ተነሳሳ።የቢል ትኩረት 0.05% መካከለኛ).ትሮፎዞይቶች በአናይሮቢክ ሁኔታዎች በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ እስከ ሎጋሪዝም የእድገት ደረጃ ድረስ ይንከባከባሉ።መካከለኛውን ወደ ሳይስቲክ ኢንዱክሪንግ መካከለኛ (pH 7.8፣ የተሻሻለ TYI-S-33 መካከለኛ ከ1% የሐሞት መጠን ጋር) እና ባህል G. duodenalis በ 37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ለ 48-96 ሰአታት ይቀይሩ ፣ በዚህ ጊዜ ምስረታ ኪስቶች በአጉሊ መነጽር ታይተዋል።አብዛኛዎቹ ትሮፖዞይቶች ሳይስት እንዲፈጠሩ ከተደረጉ በኋላ፣ የባህል ቅይጥ ተሰብስቦ በንፁህ ውሃ ውስጥ እንደገና ተንጠልጥሎ የቀሩትን ትሮፖዞይቶች lyse።ኪስቶች ተቆጥረው በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ተከማችተዋል ለቀጣይ ትንታኔዎች በአይጦች ውስጥ ባለው የጨጓራ ​​ቱቦ ውስጥ.
ቀደም ሲል እንደተገለፀው የጃርዲያ ውጫዊ ሴሉላር vesicles (GEVs) የበለፀጉ ነበሩ [13]።በሎጋሪዝም የእድገት ደረጃ ላይ ያሉ ትሮፎዞይቶች በተሻሻለው TYI-S-33 መካከለኛ ከኤክሶሶም-የተሟጠ ኤፍቢኤስ (ባዮሎጂካል ኢንዱስትሪዎች፣ ቤይት-ሀመክ፣ እስራኤል) ወደ 1 × 106 ጥገኛ ተህዋሲያን/ml የመጨረሻ ክምችት ተዘጋጅተው ለ12 ሰአታት ታግደዋል።በ 2000 ግራም ለ 10 ደቂቃዎች, 10,000 ግራም ለ 45 ደቂቃዎች, እና 100,000 ግራም ለ 60 ደቂቃዎች በሴንትሪፍ ከባህላዊ ሱፐርኔሽን ተለይተዋል.የዝናብ መጠን በፎስፌት ባፈርድ ሳላይን (PBS) ውስጥ ይሟሟል፣ በ BCA ፕሮቲን መመርመሪያ ኪት (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ፣ ዋልተም፣ ኤምኤ፣ ዩኤስኤ) እና በ-80° ሴ ተከማችቷል ወይም ለቀጣይ ትንታኔዎች በቀጥታ ጥቅም ላይ ውሏል።
ቀደም ሲል እንደተገለፀው የመጀመሪያ ደረጃ መዳፊት ፔሪቶናል ማክሮፋጅስ ተዘጋጅቷል [24].ባጭሩ፣ አይጦች (ከ6-8 ሳምንታት እድሜ ያላቸው) በ 2.5 ml 2.98% Difco ፈሳሽ ቲዮግሊኮል መካከለኛ (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) እና 3-4 palates ገብተዋል (intrapereritoneally [ip]).የማክሮፋጅስ እገዳ ከኤውታናሲያ በኋላ ከአይጥ የሆድ ክፍል ውስጥ ተሰብስቧል እና 3 ጊዜ በ 1000 ግራም ለ 10 ደቂቃዎች ሴንትሪፉድ ተደርጓል.የሕዋስ ንፅህና እስከ>98% ድረስ፣ከዚያም ወደ 6-well cell culture plates (4.5 x 106 cells/well) እና በ10% FBS (Bioindustry) በ 37°C ተጨምሮ እስኪያልቅ ድረስ በCD11b ማርከር በመጠቀም የተሰበሰቡ ሴሎች በወራጅ ሳይቶሜትሪ ተገኝተዋል።እና 5% CO2.
አር ኤን ኤ ከ 1 × 107 ትሮፖዞይቶች በ 1 ml TRIzol reagent (Vazyme, Nanjing, China), ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ከጠቅላላ G. duodenalis አር ኤን ኤ ሞንስክሪፕት dsDNase (ሞናድ, ዉሃን, ቻይና) በመጠቀም እና ተጨማሪ ዲ ኤን ኤ (ሲዲኤንኤ) ተቀላቅሏል. በአምራቹ መመሪያ መሰረት MonScript RTIIII Super Mix (Monad) በመጠቀም።
ለዒላማው G. duodenalis ጂን የሲዲኤስ ቅደም ተከተል መረጃ የተገኘው ከ NCBI GenBank ነው።ለእያንዳንዱ ኢላማ ጂን የተወሰኑ እንከን የለሽ ክሎኒንግ ፕሪመርሮችን ለመንደፍ ፕሪመር 5.0 ይጠቀሙ።የፊት ፕሪመር (5′-3′) ሶስት ክፍሎችን ያቀፈ ነው፡- ተደራቢ ቅደም ተከተል ከተመሠረተ ቬክተር ፒሲዲኤንኤ3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) እና ኮዶችን ATG እና GNN ጀምር (የመጀመሪያው መሰረት G ካልሆነ)።ይህ የሚደረገው የመግለጫውን ውጤታማነት ለማሻሻል ነው.በተጨማሪም, ቢያንስ 16 bp ጥምር መሰረት (የጂሲ ይዘት 40-60% / ቲም በግምት 55 ° ሴ).የተገላቢጦሽ ፕሪመር (5′-3′) ሁለት ክፍሎችን ያቀፈ ነው፣ተደራራቢ ቅደም ተከተል ከኢኮአርቪ-መስመር ቬክተር ፒሲዲኤንኤ3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGAT) እና ጥምር መሠረት ቢያንስ 16 ቢፒ።(ከመጨረሻዎቹ ሁለት ማቆሚያዎች በስተቀር).ቤዝ) እንደ AA ወይም GA ያለ ኮዶን (recombinant plasmids) የተሰየሙትን ፕሮቲኖች እንዲገልጹ ለማስቻል)።የፕሪመር ቅደም ተከተሎች በሰንጠረዥ 1 ውስጥ ተዘርዝረዋል እና በካንግሜት ባዮቴክኖሎጂ ኩባንያ (ቻንግቹን, ቻይና) የተዋሃዱ ናቸው.
የተዘጋጀውን G. duodenalis cDNA እንደ አብነት በመጠቀም ዒላማዎች Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, China) ወይም Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., ቤጂንግ, ቻይና) በመጠቀም ጨምረዋል።የ eukaryotic አገላለጽ ቬክተር ፕላዝማይድ ፒሲዲኤንኤ3.1(+) ከተገደበ ኢንዛይም EcoRV እና ዲፎስፈረስላይትድ የተደረገው Fast AP (Thermo Fisher Scientific) በመጠቀም ነው።ሊኒየራይዝድ ፒሲዲኤንኤ3.1(+) ቁርጥራጮች እና የተጠናከረ የዒላማ ዘረ-መል ስብርባሪዎች የዲኤንኤ ጄል ማጽጃ ኪት (ቲያንገን) በመጠቀም ተጣሩ እና ናኖድሮፕ ND-2000 (ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) በመጠቀም ተስተካክለዋል።የፒሲዲኤንኤ3.1(+) ቁርጥራጭ እና እያንዳንዱ የዒላማ ዘረ-መል ስብጥር ሞንክሎን ነጠላ መገጣጠሚያ ክሎኒንግ ድብልቅን (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) በመጠቀም እንደገና የተዋሃዱ እና በ Comate Bioscience Company Limited (ቻንግቹን, ቻይና) በመጠቀም በዲኤንኤ ቅደም ተከተል ተረጋግጠዋል..
Endotoxin-free plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 እና pcDNA3.1(+) -alpha-7.3 የተፈጠሩት SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (ሳንጎን ባዮቴክ) በመጠቀም ነው።በኤሌክትሮኒካዊ ቋት ውስጥ ያለው EDTA በተላላፊ ምርመራው ላይ ጣልቃ አለመግባቱን ለማረጋገጥ ትኩረቱ ከ500 ng/µl በላይ ተጠብቆ ቆይቷል።ዋናው የመዳፊት ፔሪቶኒል ማክሮፋጅስ በ6-ጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ ሙሉ RPMI 1640 መካከለኛ (ባዮሎጂካል ኢንዱስትሪዎች) ለ 12 ሰአታት ያዳብራሉ ከዚያም ሴሎቹ ፔኒሲሊን እና ስትሬፕቶማይሲንን ለማስወገድ በሞቀ PBS ውስጥ 3 ጊዜ ይታጠባሉ እና ከዚያም በመካከለኛው ውስጥ ሙሉ በሙሉ ተጨምረዋል ።Endotoxin-free plasmids pcDNA3.1 (+) -alpha-2 እና pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 (2.5 μg) በ 125 μl Opti-MEM የተቀነሰ የሴረም መካከለኛ (ጂብኮ, ቴርሞ ፊሸር ሳይንቲፊክ) ..ከዚያም 5 µl የሊፖፌክታሚን 2000 ማስተላለፊያ reagent (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) በ 125 μl ዝቅተኛ የሴረም ኦፕቲ-ኤምኤምኤም ውስጥ ተጨምሯል.የተሟሟትን ኢንዶቶክሲን-ነጻ ፕላዝማይድ ከ Lipofectamine 2000 ጋር በማዋሃድ እና ድብልቁ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 5 ደቂቃዎች እንዲቆይ በማድረግ የሊፕሶም-ዲ ኤን ኤ ውስብስቦችን ያዘጋጁ።ውስብስቦቹን በተናጠል ወደ እያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ ወደ ሴሎች ያስተላልፉ እና በቀስታ ይቀላቀሉ.ከ 4 ሰአታት በኋላ, የሴል ባህል መካከለኛ በ 2 ml ሙሉ RPMI 1640 መካከለኛ እና ባህል ለ 24 ሰአታት ተተካ.ትኩስ የሕዋስ ባህል መካከለኛ ወደ ሴሎቹ ተጨምሮ ለተለያዩ የጊዜ ነጥቦች እንደ አሴይ ዲዛይን ተሠርቷል።
ቀደም ሲል እንደተገለፀው የፕሮቲን ናሙናዎች ከሱፐርናታንት እና ከሴል ሊዛዎች ተዘጋጅተዋል [25].ለፕሮ-IL-1β፣ ፕሮ-ካሳሴ-1፣ ካስፓሴ-1 p20፣ NLRP3፣ β-actin እና His-tag የሜምብራን ማስተላለፊያ መለኪያዎች 200 mA/90 ደቂቃ ናቸው።ለ interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) እና NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, ስዊዘርላንድ) እና 1:5000 የእሱን መለያ (Amylet Scientific, Wuhan፣ ቻይና) እና β-actin (ፕሮቲንቴክ፣ Wuhan፣ ቻይና)።
ቀደም ሲል እንደተገለፀው ከዲሱሲኒሚሚድ ሱብሬት (DSS) ጋር መሻገር ተካሂዷል።ሴሎች በቀዝቃዛ ፒቢኤስ 3 ጊዜ ታጥበው ሙሉ በሙሉ በ27 መለኪያ መርፌ በ50µl ASC ምላሽ ቋት (pH 8.0) 25 ሚሜ Na2PO4፣ 187.5 ሚሜ ናሲል፣ 25 ሚሜ HEPES እና 125 ሚሜ NaHCO3 የያዙ።ድብልቁ በ 5000 ግ ለ 3 ደቂቃዎች ሴንትሪፉል ተደርጓል እና እንክብሉ በ 10 μl DSS (25 ሚሜ በዲኤምኤስኦ) እና በ 40 µl ASC ምላሽ ቋት ለ 30 ደቂቃ በ 37 ° ሴ.በ 5000 ግራም ለ 10 ደቂቃዎች ከተሰራ በኋላ, እንክብሉ በ 40 µl የ ASC ምላሽ ቋት እና 10 µl 6x ፕሮቲን መጫኛ ቋት (ትራንስጄን, ቤጂንግ, ቻይና) መፍትሄ ውስጥ ይሟሟል, ከዚያም መፍትሄው በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 15 ሟች. ደቂቃ, ከዚያም 10 ደቂቃዎችን ቀቅለው.የፕሮቲን ናሙናዎች በ 1:500 የዲሉሽን ሬሾ ውስጥ ዋና ፀረ-ASC ፀረ እንግዳ አካላትን (ዋንሌቢዮ, ሼንያንግ, ቻይና) በመጠቀም በምዕራቡ ዓለም እንዲጠፉ ተደርገዋል.
ቀደም ሲል የተገለጸውን አሰራር ተከትሎ [13]፣ የሕዋስ ባህል ሱፐርናታንትስ ተሰብስቦ የፕሮ-ኢንፍላማቶሪ ሳይቶኪን IL-1β ምስጢራዊነት የሚወሰነው በመዳፊት IL-1 Beta ELISA ኪት (Invitrogen፣ Thermo Fisher Scientific) በመጠቀም ነው።የ IL-1β መደበኛ ኩርባን በመጠቀም OD450nm እሴቶችን ወደ ፕሮቲን ውህዶች ይለውጡ።
በሽፋን ላይ የተሸፈኑ ሴሎች በሙቅ PBS ውስጥ 3 ጊዜ በቀስታ ታጥበዋል ፣ በቲሹ ሴል መጠገኛ (ባዮሻርፕ ፣ ቤጂንግ ፣ ቻይና) ውስጥ ለ 10 ደቂቃ በቤት ሙቀት (RT) ፣ በ 0.1% ትሪቶን ኤክስ-ፔርሜቢሊዝ በ 100 (በ PBS ውስጥ ተጨምሯል ፣ ባዮሻርፕ) ) ለ 20 ደቂቃዎች በቤት ሙቀት ውስጥ እና በ 5% ቦቪን ሴረም አልቡሚን (በፒቢኤስ) ውስጥ ለ 2 ሰዓታት በቤት ሙቀት ውስጥ ያግዱ.ከዚያም ሴሎች በአንድ ሌሊት በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ከ ASC (1:100 dilution) ወይም NLRP3 (1:100 dilution) ጋር የሚቃረኑ ዋና ፀረ እንግዳ አካላት እና Cy3 የፍየል ፀረ-ጥንቸል IgG (H+L) (1:400; EarthOx) , ሳን ፍራንሲስኮ, ካሊፎርኒያ, ዩኤስኤ) ወይም FITC-የተዋሃደ የፍየል ፀረ-መዳፊት IgG (1:400; Earthox) በአንድ ምሽት በ 37 ° ሴ በጨለማ ለ 1 ሰዓት.ኒውክሊየሎቹ በ Hoechst 33258 (10 μg / ml; UE, Suzhou, China) ለ 5 ደቂቃዎች ተበክለዋል እና በፍሎረሰንት ማይክሮስኮፕ (ኦሊምፐስ ኮርፖሬሽን, ቶኪዮ, ጃፓን) ውስጥ ታይተዋል.
አይጦች በአራት ቡድን ተከፍለዋል (n = 7 በእያንዳንዱ ቡድን): (i) PBS-የታከመ አሉታዊ ቁጥጥር ቡድን (PBS ብቻ; gavage 100 μl/mouse PBS እና በየቀኑ intraperitoneal መርፌ 100 µl/mouse PBS 3 ሰዓታት በኋላ) ., ያለማቋረጥ ለ 7 ቀናት);(ii) አሉታዊ ቁጥጥር ቡድን በMCC950 inhibitor [27] (100 µl/mouse በPBS gavage፣ ከ3 ሰአታት በኋላ፣ 10 mg/kg የሰውነት ክብደት [BW] MCC950 [በPBS] በቀን intraperitoneally፣ የቆይታ ጊዜ 7 ቀናት) ታክሟል።(iii) G. duodenalis cyst infection ቡድን (1.5 x 106 ሳይስቲክ / አይጥ በጋቫጅ, ከ 3 ሰዓታት በኋላ, 100 μl / mouse PBS intraperitoneally በየቀኑ ለ 7 ቀናት ይተዳደራል);(iv) G. duodenalis cyst ጥምር ኢንፌክሽን ቡድን MCC950 inhibitor ሕክምና ቡድን (1.5 × 106 cysts / በ gavage በኩል መዳፊት, 10mg / ኪግ የሰውነት ክብደት MCC950 intraperitoneally ለ 7 ቀናት 3h ላይ).የእያንዳንዱ አይጥ የሰውነት ክብደት በየቀኑ ቁጥጥር ይደረግበታል እና ሁሉም አይጦች በ 7 ኛው ቀን ተገድለዋል.የተሰበሰበ ዱዶነም (3 ሴ.ሜ ርዝመት ያለው) በ 1 ሚሊር ፒቢኤስ ውስጥ በትንሽ ቁርጥራጮች ተቆርጧል, ሲስቲክስ በአንድ ምሽት በፒቢኤስ በ 4 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና ጂ. duodenalis trophozoites ተደምስሷል.ትኩስ duodenum (1 ሴ.ሜ ርዝመት ያለው) ለሄማቶክሲሊን እና ለኢኦሲን (H&E) ቀለም ተለይቷል።
አይጦች በሁለት ቡድን ተከፍለዋል፡ (i) MOCK መቆጣጠሪያ ቡድን እና (ii) MCC950 አጋቾች ቡድን።በእያንዳንዱ ቡድን ውስጥ አምስት ሕክምናዎች ነበሩ (n = 7 / የሕክምና ቡድን): (i) PBS ሕክምና አሉታዊ ቁጥጥር ቡድን (PBS ብቻ; 100 µl / mouse PBS, intramuscular (IM) መርፌ (tibialis anterior) [28, 29]; ii) pcDNA3.1(+) ፕላዝማይድ አሉታዊ ቁጥጥር ቡድን (100 μg/መዳፊት ዲ ኤን ኤ፣ በጡንቻ ውስጥ መርፌ በኩል) (iii) G. duodenalis cyst infection positive control group (1.5 x 106 cysts/mouse, through gavage) (iv) a በፕላዝማድ ፒሲዲኤንኤ3.1(+) -alpha-2 (100 μg/mouse DNA፣ intramuscular injection) እና (v) በፕላዝማይድ pcDNA3.1(+) -alpha-7.3 (100 μg/mouse) የታከመ ቡድን ዲ ኤን ኤ, ከ 12 ሰአታት ማለፊያ በኋላ, በ MCC950 inhibitor ቡድን ውስጥ ያሉ አይጦች በየቀኑ የ MCC950 (10 mg / kg የሰውነት ክብደት) ለ 7 ቀናት intraperitoneal መርፌ ሲወስዱ በ MOCK ቡድን ውስጥ ያሉት አይጦች በእኩል መጠን የ PBS ሕክምናን አግኝተዋል የደም ናሙናዎች ተወስደዋል. ከዓይን ኳሶች የተሰበሰቡ እና በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ የቀሩ የሴረም ናሙናዎች ከኤንዛይም ጋር የተገናኘ የበሽታ መከላከያ ምርመራ (ELISA) ለ IL-1β ደረጃዎች ተለይተዋል.
ሠላሳ አምስት አይጦች በአምስት ቡድን ተከፍለዋል (n=7/ቡድን)።ቡድን 1 በPBS የታከመ አሉታዊ የቁጥጥር ቡድን ነበር፡ አይጦች 100 μl PBS በጡንቻ ውስጥ እና ከ3 ቀናት በኋላ በጋቫጅ ተቀብለዋል።ቡድን 2 በ G. duodenalis cysts የተበከለው አወንታዊ የቁጥጥር ቡድን ነው፡ አይጦች በ 100 μl PBS ተወጉ እና ከ 3 ቀናት በኋላ 1.5 x 106 ሳይሲስ/አይጥ ወደ ውስጥ ገብተዋል።ሦስተኛው ቡድን - ፕላዝማይድ ክትባት ከ pcDNA3.1 (+) ጋር ከቁጥጥር ቡድን ጋር በማጣመር ለ duodenal cyst ኢንፌክሽን: አይጦች 100 μg ፕላዝማዲ ዲ ኤን ኤ ፒሲዲኤንኤ3.1 (+) (im) በአፍ ፣ 1.5 × 106 cysts/mouse 3 ለብዙ ተቀበሉ። ቀናት.ቡድኖች 4 እና 5 recombinant pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine plasmid ወይም pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardine plasmid ከጂ duodenalis cyst ኢንፌክሽን ጋር ተጣምሮ።የሙከራ ቡድን፡ አይጦች 100 μg ፒሲዲኤንኤ3 ተቀብለዋል።1(+) -ጃርድዲን ፕላዝማይድ ዲ ኤን ኤ (ኢም)፣ ከዚያም ከ3 ቀናት በኋላ፣ 1.5 × 106 ሳይሲስ/አይጥ በጋቫጅ ተወግዷል።የ G. duodenalis cyst በቱቦው ውስጥ ከገባ በኋላ የእያንዳንዱ መዳፊት የሰውነት ክብደት ክትትል ይደረግበታል።ትኩስ ዱዶነም የተሰበሰበው ለጥገኛ ጭነት መለኪያዎች እና ለኤችአይዲ ቀለም ትንተና ነው።
ሂስቶፓቶሎጂካል ለውጦች ቀደም ሲል በታተመ አሰራር መሰረት ተንትነዋል [30].ትኩስ ዱዶነም በቲሹ ሕዋስ መጠገኛ ተስተካክሏል፣ በፓራፊን ውስጥ ተተክሏል፣ በ4 μm ክፍሎች ተቆርጧል፣ በH&E ተበክሏል እና በብርሃን ማይክሮስኮፕ ተተነተነ።ከሰባት ገለልተኛ አይጦች ውስጥ በሰባት የቲሹ ክፍሎች ውስጥ ያሉ ተወካዮች የፓቶሎጂ ለውጦች ስለ ህክምናው ሳያውቁ በፓቶሎጂስት ተገምግመዋል እና በ 200x ማጉላት ተይዘዋል ።ቀደም ሲል በተገለጹት ዘዴዎች መሠረት የቪሊው ርዝመት እና የክሪፕትስ ጥልቀት ይለካሉ.
በብልቃጥ እና በ vivo የተገኘው ውጤት በሶስት እጥፍ ተገኝቷል።ግራፎች የተፈጠሩት GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc.፣ La Jolla, CA, USA)ን በመጠቀም ነው።በሁለት ቡድኖች መካከል ያለው ልዩነት በቲ-ሙከራ የተተነተነ ሲሆን በ ≥3 ቡድኖች መካከል ያለው ልዩነት በ SPSS ሶፍትዌር (ስሪት 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) በመጠቀም የአንድ-መንገድ ልዩነት (ANOVA) ተተነተነ.መረጃ ለልዩነት ተመሳሳይነት የተተነተነው የሌቨን ፈተናን በመጠቀም ሲሆን በመቀጠልም የቦንፈርሮኒ የድህረ ሆክ ፈተና (ቢ) ነው።ትርጉሙ እንደ P<0.05, P<0.01, እና P<0.001 (ጠቃሚ ያልሆነ [ns]) (P>0.05) ይገለጻል።
በኪዮቶ ኢንሳይክሎፔዲያ ኦቭ ጂኖች እና ጂኖም (KEGG) ውስጥ የኛ ቀደም ሲል የ GEV ፕሮቲዮቲክስ ትንታኔ እንደሚያሳየው ብዙ ኢላማዎች የእሳት ማጥፊያ መንገዶችን በማግበር ላይ ሊሳተፉ ይችላሉ [13].ሁለት ተስፋ ሰጪ ኢላማዎችን መርጠናል፣ alpha-2 እና alpha-7.3 giardins፣ እነዚህን ሞለኪውሎች በማጉላት ፒሲዲኤንኤ3.1(+) eukaryotic express vector ን ለመገንባት ተጠቀምን።ከተከታታይ በኋላ፣ recombinant pcDNA3.1(+) -alpha-2 እና alpha-7.3 giardine expression ፕላዝማይድ ወደ ዋና መዳፊት ፔሪቶናል ማክሮፋጅስ ተለወጡ፣ እና የ caspase-1 p20 ፊርማ ፕሮቲን ኢንፍላማቶሪ (የነቃ ካፓስሴ-1 ቁራጭ) ተለይቷል። እብጠትን ሊያስከትሉ የሚችሉ ቁልፍ ሞለኪውሎችን እንደሚያብራሩ።ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት alpha-2 እና alpha-7.3 giardines p20 caspase-1 ከጂኢቪ ጋር የሚመሳሰል አገላለጽ ሊፈጥሩ ይችላሉ።ካልታከመ አሉታዊ ቁጥጥር (PBS ብቻ) እና ፕላዝማይድ መቆጣጠሪያ pcDNA3.1 (+) (ምስል 1) በካስፓዝ-1 ማግበር ላይ ምንም ተጽእኖ አልተገኘም።
የ p20 caspase-1 አግብር በpcDNA3.1(+) -alpha-2 እና alpha-7.3 giardins መለካት።ዳግም የተዋሃዱ eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 እና alpha-7.3 giardines (ከእያንዳንዱ መስመር በላይ) ወደ ቀዳሚ አይጥ ፐርቶናል ማክሮፋጅስ ተለውጠዋል እና የባህል ሱፐርናታንትስ ከ24 ሰአት በኋላ ተሰብስቧል።የምዕራቡ መጥፋት የፊርማ ካስፓሴ-1 p20 የሚያቃጥል ፕሮቲን መግለጫ ደረጃዎችን ለመለካት ጥቅም ላይ ውሏል።የፒቢኤስ-ብቻ ሕክምና ቡድን (ሌይን C) እና ፒሲዲኤንኤ3.1(+) ሞኖቴራፒ ቡድን (pcDNA3.1 ሌን) እንደ አሉታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ውለው ነበር፣ እና የ GEV ሕክምና ቡድን እንደ አወንታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ውሏል።የድጋሚ ፕሮቲን አገላለጽ በእያንዳንዱ ፕሮቲን ውስጥ የሂስታዲን መለያን በመለየት የተረጋገጠ ሲሆን የሚጠበቁት የፕሮቲን ባንዶች አልፋ-2 ጂአርዲን (38.2 ኪዳ) እና አልፋ-7.3 ጃርዲን (37.2 ኪዳ) ናቸው።GEV፣ Giardia duodenum extracellular vesicles፣ pcDNA3.1(+)፣ EcoRV-linearized vector፣ SUP፣ supernatant
alpha-2 giardine እና alpha-7.3 giardine p20 caspase-1 አገላለጽ እንዲፈጠር እና አስተናጋጁን NLRP3 ኢንፍላማቶሪ ምላሽን በማንቃት ሚና ይጫወቱ እንደሆነ ለማወቅ pcDNA3.1(+) -alpha-2 giardine እና pcDNA3.1(+) -alpha -7.3 giardin ወደ ቀዳማዊ መዳፊት ፔሪቶናል ማክሮፋጅስ ከ recombinant plasmid DNA ጋር ተለውጧል፣ እና የገለፃ፣ የትርጉም እና ኦሊጎሜራይዜሽን ቁልፍ ቁልፍ ፕሮቲኖች NLRP3 ተወስኗል።በዚህ ሙከራ፣ GEV እንደ አወንታዊ ቁጥጥር ቡድን ጥቅም ላይ ውሏል፣ እና ምንም አይነት የህክምና ቡድን (PBS ብቻ) ወይም ፒሲዲኤንኤ3.1(+) የመተላለፊያ ህክምና ቡድን አሉታዊ ቡድን ነው።ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት በጂኢቪ ቡድን ውስጥ የጂአርዲን ፒሲዲኤንኤ3.1(+) -alpha-2 እና giardin pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 recombinant plasmid DNA የ NLRP3 ፕሮ-IL-1β እና procaspase-1 እና caspase-1 ማግበር (ምስል 2 ሀ).በተጨማሪም, ሁለቱም ጂአርዲን ጉልህ የሆነ የ IL-1β ሚስጥራዊነት (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;አልፋ-7.3 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (ምስል 2 ለ).አብዛኛዎቹ የ ASC ፕሮቲኖች ሞኖሜሪክ በሌለበት ሕክምና ቡድን ውስጥ ወይም በፒሲዲኤንኤ3.1 (+) ፕላዝማይድ በተሸጋገሩ የሕክምና ቡድን ውስጥ ከፒሲዲኤንኤ3.1 (+) -አልፋ-2 ወይም ፒሲዲኤንኤ3.1 (+) - አልፋ- 7.3 ጃርዲን.ASC oligomerization የተከሰተው በ GEV አወንታዊ ቁጥጥር ቡድን ወይም ቡድን recombinant plasmid DNA ውስጥ ሲሆን ይህም ኦሊጎሜሪክ ቅርፅን ያሳያል (ምስል 2 ሐ)።እነዚህ የመጀመሪያ መረጃዎች እንደሚያመለክቱት alpha-2 giardine እና alpha-7,3 giardine የ NLRP3 ብግነት እንቅስቃሴን ሊያነሳሳ ይችላል.የ ASC እና NLRP3 አካባቢያዊነት ቀጣይ የ immunofluorescent ጥናቶች እንደሚያሳዩት በአሉታዊ ቁጥጥር ቡድን ውስጥ የኤኤስሲ ፕሮቲን በሳይቶፕላዝም ውስጥ ተበታትኖ እና ፒሲዲኤንኤ3.1 (+) -አልፋ-2 ከጃርዲን ወይም ፒሲዲኤንኤ3 ጋር በማነሳሳት እንደ ነጥብ ምልክት ታየ።1 (+) - አልፋ-7,3 የጃርዲን ቡድን ወይም GEV አወንታዊ ቁጥጥር ቡድን (ምስል 2 መ).በአሉታዊ ቁጥጥር እና በፕላዝሚድ-የተያዙ ፒሲዲኤንኤ 3.1 ቡድኖች የ NLRP3 ፕሮቲን ምልክት አልተገኘም ፣ ለ pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine ወይም pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 ምላሽ የፍሎረሰንት ምልክት ነጥብ ተገኝቷል።.giardine በሳይቶፕላዝም ውስጥ ወይም በ HEV ማነቃቂያ (ምስል 2e) ውስጥ ይገኛሉ.እነዚህ መረጃዎች እንደሚያሳዩት G. duodenalis giardin alpha-2 እና giardin alpha-7.3 NLRP3 inflammasome in mouse primary peritoneal macrophages.
ፒሲዲኤንኤ3.1(+)-alpha-2 giardin እና pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin የ NLRP3 ኢንፍላማሶም በመዳፊት ፔሪቶናል ማክሮፋጅስ ውስጥ ያነቃል።የ recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin እና pcDNA3.1(+) -alpha-7.3 giardin ወደ አንደኛ ደረጃ የ murine peritoneal macrophages እና ህዋሶች ቀይር ወይም በ 24 ሰአት ውስጥ ከመጠን በላይ መጨናነቅ አገላለፅን ለመተንተን፣ oligomerization , ምስጢር.እና ቁልፍ የሚያቃጥሉ ፕሮቲኖች አካባቢ.የ PBS-only (C) ቡድን እና ፒሲዲኤንኤ3.1 (+) ነጠላ የሕክምና ቡድን እንደ አሉታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ውለው ነበር፣ እና የ GEV ህክምና ቡድን እንደ አወንታዊ ቡድን ጥቅም ላይ ውሏል።NLRP3፣ pro-IL-1β፣ pro-caspase-1 እና p20 caspase-1ን ጨምሮ ቁልፍ የሚያነቃቁ ፕሮቲኖች NLRP3 በምዕራቡ መጥፋት ተገኝተዋል።ለ IL-1β በሱፐርኔቶች ውስጥ ያለው የምስጢር መጠን የሚወሰነው ከኤንዛይም ጋር የተያያዘ የበሽታ መከላከያ ምርመራ (ELISA) በመጠቀም ነው.በ SPSS ሶፍትዌር ስሪት 22.0 በመጠቀም የቁጥጥር እና የሙከራ ቡድኖች ልዩነት በአንድ-መንገድ ልዩነት (ANOVA) ተተነተነ።ኮከብ ቆጣሪዎች በቡድኖች መካከል ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ ** P<0.01 እና *** P<0.001.c ASC oligomerization pellets በዲኤስኤስ አቋራጭ ትንተና የሚወሰኑ ሲሆን በሴል lysates ውስጥ ያሉት የኤኤስሲ ደረጃዎች እንደ የመጫኛ መቆጣጠሪያ ጥቅም ላይ ይውላሉ።d immunofluorescenceን በመጠቀም የ ISC አከባቢን ማየት።ሠ Immunofluorescence የ NLRP3 አካባቢያዊነትን ለማየት ጥቅም ላይ ውሏል።ASC, አፖፖቲክ ስፔክ-እንደ ፕሮቲን;IL, interleukin;NLRP3, ኑክሊዮታይድ-ቢንዲንግ oligomerization-እንደ ተቀባይ 3;ns፣ ጉልህ አይደለም (P> 0.05)
ሁለቱም G. duodenalis እና የሚስጥርባቸው GEVs NLRP3 ኢንፍላማሶም ያንቀሳቅሳሉ እና በብልቃጥ ውስጥ የአስተናጋጅ እብጠት ምላሾችን ይቆጣጠራሉ።ስለዚህ, G. duodenalis ያለውን pathogenicity ውስጥ NLRP3 inflammasome ሚና ግልጽ ነው.ይህንን ጉዳይ ለመመርመር በጂ duodenalis cyst በተያዙ አይጦች እና በጂ duodenalis cyst + MCC950 inhibitor ሕክምና በተያዙ አይጦች መካከል ሙከራን ነድፈናል እና በ G. duodenalis cyst በሚበከልበት ጊዜ NLRP3 ኢንፍላማሜም አገላለጽ አነፃፅር።የሙከራው ዝርዝር እቅድ በስእል 3 ሀ.በተለያዩ የሕክምና ቡድኖች ውስጥ ያሉ አይጦች በሰውነት ክብደት ላይ የሚደረጉ ለውጦች በሳይሲስ ከተያዙ በኋላ ለ 7 ቀናት ክትትል ይደረግባቸዋል, ውጤቱም በስእል 3 ለ.በንጹህ PBS ከታከመው ቡድን ጋር ሲነፃፀር ውጤቱ እንደሚያሳየው (i) በጂ duodenalis cyst የተያዙ አይጦች የሰውነት ክብደት ከበሽታው በኋላ ከ 3 እስከ 7 ቀን ቀንሷል ።(ii) ከ MCC950 አጋቾቹ ጋር የሚደረግ ሕክምና በአይጦች የሰውነት ክብደት ላይ ምንም ጠቃሚ ተጽእኖ አልነበረውም..ከአንዱ የኢንፌክሽን ቡድን ጋር ሲነፃፀር በኤምሲሲ950 የታከመው የ duodenal ኢንፌክሽን ቡድን BW ወደ የተለያዩ ዲግሪዎች ቀንሷል (ቀን 1: ANOVA, F (3, 24) = 1.885, P = 0.0148; ቀን 2: ANOVA, F (3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; ቀን 3: ANOVA, F (3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; ቀን 4: ANOVA, F (3, 24) = 1.683, P = 0.0052; ቀን 5: A (3, 24) = 0.6497, P=0.0645; ቀን 6: ANOVA, F (3, 24) = 5.457, P=0.0175; ቀን 7: ANOVA, F (3, 24) = 2.893, P = 0.0202).እነዚህ መረጃዎች እንደሚያሳዩት የ NLRP3 ኢንፍላማሶም አይጦችን ከከፍተኛ ክብደት መቀነስ በመጀመሪያዎቹ ደረጃዎች (ከ2-4 ቀናት) የ duodenal ኢንፌክሽን ይከላከላል.ከዚያም ጂ. duodenalis trophozoites በ duodenal lavage ፈሳሽ ውስጥ ፈልጎ ማግኘት እና ውጤቶቹ በስእል 3 ሐ.ከ G. duodenalis cyst infection ቡድን ጋር ሲነጻጸር, NLRP3 ኢንፍላማሶም (t (12) = 2.902, P = 0.0133) ከከለከለ በኋላ በ duodenum ውስጥ ያሉ የትሮፖዞይቶች ቁጥር በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል.በኤችአይኤ የተበከሉት የዱዮዲናል ቲሹዎች በፒቢኤስ እና ኤምሲሲ950 ብቻ ከታከሙት አሉታዊ ቁጥጥር ጋር ሲነፃፀሩ፡(i) G. duodenalis cyst infection በ duodenal villi ላይ ጉዳት አስከትሏል (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P= 0.0488 ) እና crypt atrophy (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) በጂ duodenalis cysts የተበከሉ አይጦች እና በMCC950 አጋቾች የታከሙ ዶኦዲነም።duodenal villi ተጎድቷል እና ሞተዋል (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) እየመነመኑ እና ክሪፕት ቅርንጫፍ (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (ምስል 3d-). ረ)እነዚህ ውጤቶች NLRP3 inflammasome G. duodenalis ያለውን በሽታ አምጪ በመቀነስ ረገድ ሚና ይጫወታል.
በ Giardia duodenum ኢንፌክሽን ውስጥ የ NLRP3 ኢንፍላማቶሚ ሚና.አይጦች በ duodenococcal cysts ጋቫጅድ (iv) ተደርገዋል እና ከዚያም በኤምሲሲ950 (ip) ወይም ያለ ህክምና ታክመዋል።ነጠላ የሕክምና ቡድኖች ከፒቢኤስ ወይም ኤምሲሲ950 ጋር እንደ መቆጣጠሪያዎች ጥቅም ላይ ውለዋል.የሙከራ ቡድን እና የሕክምና ዘዴ.b በእያንዳንዱ የተለያዩ የሕክምና ቡድኖች ውስጥ ያሉት የአይጦች የሰውነት ክብደት ለ 7 ቀናት ክትትል ተደርጓል.በ G. duodenalis ኢንፌክሽን ቡድን እና በ G. duodenalis + MCC950 የኢንፌክሽን ሕክምና ቡድን መካከል ያለው ልዩነት በ SPSS ሶፍትዌር ስሪት 22.0 በመጠቀም በቲ-ሙከራ ተተነተነ።ኮከቦች በ *P<0.05፣ **P<0.01፣ ወይም ***P<0.001 ላይ ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ።c ጥገኛ ሎድ የሚወሰነው በ duodenal lavage ፈሳሽ ውስጥ የትሮፖዞይተስ ብዛት በመቁጠር ነው።በ G. duodenalis ኢንፌክሽን ቡድን እና በ G. duodenalis + MCC950 የኢንፌክሽን ሕክምና ቡድን መካከል ያለው ልዩነት በ SPSS ሶፍትዌር ስሪት 22.0 በመጠቀም በቲ-ሙከራ ተተነተነ።ኮከቦች በ * P <0.05 ላይ ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ.d Hematoxylin እና eosin (H&E) የ duodenal histopathology ቀለም ውጤቶች.ቀይ ቀስቶች በቪሊው ላይ መጎዳትን ያመለክታሉ, አረንጓዴ ቀስቶች በ crypts ላይ ጉዳት ያመለክታሉ.የመጠን አሞሌ፡ 100µmሠ, f የ duodenal villus ቁመት እና የመዳፊት ክሪፕት ቁመት ስታቲስቲካዊ ትንታኔ።ኮከቦች በ * P<0.05 እና **P<0.01 ላይ ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ።ውጤቶቹ የተወሰዱት ከ 7 ነጻ ባዮሎጂያዊ ሙከራዎች ነው.BW, የሰውነት ክብደት;ig, የውስጠ-ጨጓራ መጓጓዣ መንገድ;ip, intraperitoneal መላኪያ መንገድ;ns, ጉልህ አይደለም (P> 0.05);ፒ.ቢ.ኤስ, ፎስፌት ቡፈርድ ጨው;WT ፣ የዱር ዓይነት
የ IL-1β ምስጢራዊነት የእሳት ማጥፊያ እንቅስቃሴ ምልክት ነው.G. duodenalis alpha-2 giardine እና alpha-7.3 giardine የ NLRP3 አስተናጋጅ ኢንፍላማሶም በ Vivo ውስጥ ማግበር አለመሆኑን ለማወቅ፣ ያልታከሙ የWT አይጦች (የሻም ቡድን) እና NLRP3 ኢንፍላማሶም የታገዱ አይጦች (MCC950 የተከለከለ የህክምና ቡድን) ተጠቀምን።የሙከራው ዝርዝር እቅድ በስእል 4 ሀ.የሙከራ ቡድኖች በፒቢኤስ የታከሙ አይጦችን፣ G. duodenalis cyst በጋቫጅ፣ በጡንቻ ውስጥ የፒሲዲኤንኤ3.1 መርፌ እና የ pcDNA3.1(+) -alpha-2 giardine ወይም pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine በጡንቻ ውስጥ የሚወጉ አይጦችን ያካተቱ ናቸው።የ recombinant plasmid intramuscularly አስተዳደር በኋላ በ 7 ኛው ቀን, የሴረም ተሰብስቦ ነበር እና በእያንዳንዱ ቡድን ውስጥ IL-1β ደረጃ ተወስኗል.በስእል 4b ላይ እንደሚታየው በ MOCK ቡድን ውስጥ: (i) ከ PBS ቡድን ጋር ሲነጻጸር, pcDNA3.1 ሕክምና በ IL-1β secretion (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P=0.9998) ላይ ምንም ጠቃሚ ተጽእኖ አልነበረውም. የ IL-β ሚስጥር በ G. duodenalis cyst ቡድን (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine እና pcDNA3 ውስጥ በከፍተኛ ደረጃ ከፍ ብሏል.1- የአልፋ-7.3 ጃርዲን ኢንትሮሲካል መርፌ የሴረም IL-1β ደረጃዎችን በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine በ pcDNA3.1-alpha-2 giardine intramuscular injection ቡድን (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0333) ውስጥ ከፍተኛ የ IL -1β ሚስጥራዊነት አስከትሏል. .በ MCC950 ህክምና ቡድን እና በ MOCK ቡድን ውስጥ ካሉት እያንዳንዱ ቡድኖች ጋር ሲነፃፀሩ: (i) IL-1β በ PBS ቁጥጥር ቡድን እና በ pcDNA3.1 የቁጥጥር ቡድን ውስጥ የ MCC950 አጋቾቹን ከከለከሉ በኋላ በተወሰነ መጠን ቀንሰዋል, ነገር ግን ልዩነቱ አልነበረም. ጉልህ (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950ን ካገደ በኋላ።, IL-1β ሚስጥር በ G. duodenalis cyst-infected ቡድን, pcDNA3.1-alpha-2 giardine ቡድን እና ፒሲዲኤንኤ3.1-አልፋ-7.3 giardine ቡድን (ጂ. duodenalis: ANOVA, F (9) ውስጥ በእጅጉ ቀንሷል. , 58) = 3.540, P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (9) ) = 3.540, P = 0.0164).እነዚህ ውጤቶች እንደሚጠቁሙት አልፋ-2 ጂአርዲን እና አልፋ-7.3 ጂአርዲን የ NLRP3 ኢንፍላማሶም ኢንቫይሮን ማነቃቃትን ያካሂዳሉ።
pcDNA3.1(+) -ጃርድዲኖች የ NLRP3 አስተናጋጅ ኢንፍላማሶም በ Vivo ውስጥ ያነቃሉ።አይጦች በ recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+) -alpha-2 giardine ወይም pcDNA3.1(+) -alpha-7.3 giardine እና ከዚያም በMCC950 (IP፣ MCC950 ቡድን) ወይም አልታከሙም (ዱሚ ቡድን) ).የፒቢኤስ ወይም ፒሲዲኤንኤ3.1 (+) ፕላዝማይድ ሕክምና ቡድን እንደ አሉታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ውሏል፣ የጂ.የሙከራ ቡድን እና የሕክምና ዘዴ.ለ አይጥ ውስጥ ያለው የ IL-1β የሴረም መጠን በ 7 ቀን በ ELISA assay ተለካ።በ MOCK ቡድን ውስጥ ባሉ ቡድኖች መካከል ያለው ልዩነት አንድ-መንገድ ANOVA በመጠቀም የተተነተነ ሲሆን በ MOCK ቡድን እና በኤምሲሲ950 ቡድን መካከል ያለው ልዩነት የ SPSS ሶፍትዌር ስሪት 22.0 ቲ-ሙከራን በመጠቀም ተተነተነ።ኮከቦች በ MOCK ቡድን ውስጥ ባሉ የሕክምና ቡድኖች መካከል ከፍተኛ ልዩነቶችን ያመለክታሉ, * P<0.05 እና *** P<0.001;የዶላር ምልክቶች ($) በእያንዳንዱ ቡድን በ MOCK ቡድን እና በMCC950 ቡድን መካከል በP<0.05 መካከል ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ።የሰባት ገለልተኛ ባዮሎጂያዊ ሙከራዎች ውጤቶች።i፣ intramuscular injection፣ ns፣ ጉልህ ያልሆነ (P > 0.05)
የ NLRP3 አስተናጋጅ ኢንፍላማሶም በ G. duodenalis ኢንፌክሽኑ ላይ የአልፋ-2 እና የአልፋ-7.3 giardine-mediated activation የሚያስከትለውን ውጤት ለመመርመር WT C57BL/6 አይጦችን እንጠቀማለን እና alpha-2 giardine እና alpha-7.3 giardine ን እንከተላለን።ፕላዝማይድ በጡንቻ ውስጥ በመርፌ ከ 3 ቀናት በኋላ በጂ ዱዶዲናሊስ ሳይስት የጨጓራ ​​ቱቦ ውስጥ ገብቷል ፣ ከዚያ በኋላ አይጦቹ ለ 7 ቀናት ታይተዋል።የሙከራው ዝርዝር እቅድ በስእል 5 ሀ.የእያንዳንዱ አይጥ የሰውነት ክብደት በየቀኑ ይለካል, ትኩስ የዱድዶናል ቲሹ ናሙናዎች በጨጓራ ቱቦ ውስጥ ከተሰጡ በ 7 ኛው ቀን ውስጥ የተሰበሰቡ ናቸው, የትሮፖዞይተስ ብዛት ይለካሉ እና ሂስቶፓቲካል ለውጦች ተስተውለዋል.በስእል 5b ላይ እንደሚታየው የምግብ ጊዜ እየጨመረ በሄደ ቁጥር በእያንዳንዱ ቡድን ውስጥ ያሉት አይጦች BW ቀስ በቀስ ጨምረዋል።የጂ duodenalis cysts intragastric አስተዳደር በኋላ በ 3 ኛው ቀን አይጦች መካከል MT መቀነስ ጀመረ, እና ቀስ በቀስ እየጨመረ.በአልፋ-2 ጃርዲን እና በአልፋ7.3 giardine በጡንቻ መርፌ ምክንያት የተፈጠረ የNLRP3 ኢንፍላማሶም ማግበር አይጥ ላይ የክብደት መቀነስ በእጅጉ ቀንሷል (ቀን 1፡ pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 ቀን 1፡ pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 ቀን 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; ቀን 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 ቀን 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.8222, P = 0.0083; ቀን 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F (4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, ቀን 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.5620, P <0.0001, ቀን 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.9728, P <0.0001 ቀን 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.9728, P <0.0001 ቀን 6: pcDNA3 alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, ቀን 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;ቀን 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.5369, P<0.0001 ቀን 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001)የፓራሲቲክ ሸክም በ duodenum (ምስል 5 ሐ) ውስጥ ተገምግሟል.ካልታከመው አወንታዊ ቁጥጥር እና በባዶ ፒሲዲኤንኤ3.1 ቬክተር ከተረጨ ቡድን ጋር ሲነፃፀር በ α-2 giardine እና α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha) በተከተቡ ቡድኖች ውስጥ የጂ duodenalis trophozoites ቁጥር በእጅጉ ቀንሷል። -2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P<0.0001).በተጨማሪም giardine alfa-7.3 ከ giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081) ይልቅ በአይጦች ውስጥ የበለጠ መከላከያ ነበር.የ HE ቀለም ውጤቶች በ fig.5 ዲ–ረበአልፋ-2 ጃርዲን እና በአልፋ-7.3 ጃርዲን የተወጉ አይጦች በ ‹G. duodenalis› የተወጉ አይጥ እና አይጥ ከባዶ ፒሲዲኤንኤ3 ቬክተር .1 አጉላ ጋር በ G. duodenalis ከተከተቱት አይጦች ጋር ሲነፃፀር በቪለስ ጉዳት የሚገለጥ የ duodenal ቲሹ ቁስሎች ያነሱ ናቸው።(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0.0035 ወይም P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0.0028 ወይም P = 0.0055) እና የተቀነሰ crypt atrophy (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.470, P = 0.0264 or P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine , F (3, 24) = 1.470, P = 0.0371 ወይም P = 0.0191).እነዚህ ውጤቶች እንደሚያሳዩት alpha-2 giardine እና alpha-7,3 giardine የ G. duodenalis ኢንፌክሽኑን በ NLRP3 ኢንፍላማሶም ውስጥ በማንቃት.
በ G. duodenalis ኢንፌክሽን ውስጥ የpcDNA3.1 (+) -giardins ሚና።አይጦች በ recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+) -alpha-2 giardine ወይም pcDNA3.1(+) -alpha-7.3 giardine እና ከዚያም በጂ duodenalis cysts (ig) ተሟገቱ።የፒቢኤስ ቡድን እና ፒሲዲኤንኤ3.1(+) + duodenal cyst treatment ቡድን እንደ አሉታዊ ቁጥጥር ቡድኖች ጥቅም ላይ ውለው ነበር፣ እና የ duodenal cyst ህክምና ቡድን እንደ አወንታዊ ቁጥጥር ቡድን ጥቅም ላይ ውሏል።የሙከራ ቡድን እና የሕክምና ዘዴ.b በእያንዳንዱ የተለያዩ የሕክምና ቡድኖች ውስጥ ያሉት አይጦች ኤምቲ ከፈተና በኋላ ለ 7 ቀናት ክትትል ተደርጓል።ኮከቦች በ G. duodenalis ቡድን እና በፒሲዲኤንኤ3.1 (+) -alpha-2 giardine ቡድን, * P <0.05, ** P <0.01, እና *** P <0.001;የዶላር ምልክት ($) ​​በእያንዳንዱ የ G. duodenalis ቡድን እና በpcDNA3.1(+) -alpha-7.3 jardine ቡድን፣ $$P<0.01 እና $$$P<0.001 መካከል ያለውን ጉልህ ልዩነት ያሳያል።c የፓራሲቲክ ጭነት የሚወሰነው በ 1 ሚሊ ሜትር የዶዲናል ላቫጅ ከድድ (3 ሴ.ሜ ርዝመት) ውስጥ የትሮፖዞይተስ ቁጥርን በመቁጠር እና በሴሜ ዶንዲነም ውስጥ እንደ ጥገኛዎች ብዛት ይገለጻል.በ G. duodenalis ኢንፌክሽን ቡድን, በ pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine ቡድን እና በ pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardine ቡድን መካከል ያለው ልዩነት በ SPSS ሶፍትዌር ስሪት 22.0 በመጠቀም በአንድ መንገድ ANOVA ተንትነዋል.ኮከቦች በ ** P<0.01 እና ***P<0.001 ላይ ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ።d በ duodenum ውስጥ ሂስቶፓቲካል ለውጦች.ቀይ ቀስቶች በቪሊው ላይ መጎዳትን ያመለክታሉ, አረንጓዴ ቀስቶች በ crypts ላይ ጉዳት ያመለክታሉ.የመጠን አሞሌ፡ 100µmሠ, f የመዳፊት duodenal villus ቁመት (ሠ) እና ክሪፕት ቁመት (ረ) ላይ ስታቲስቲካዊ ትንተና.በስዕል 1d ውስጥ በቡድኖች መካከል ያለው ልዩነት በSPSS ሶፍትዌር ስሪት 22.0 በመጠቀም በአንድ-መንገድ ANOVA ተተነተነ።ኮከቦች በ * P<0.05 እና **P<0.01 ላይ ጉልህ ልዩነቶችን ያመለክታሉ።የሰባት ገለልተኛ ባዮሎጂያዊ ሙከራዎች ውጤቶች።ns፣ ጉልህ አይደለም (P> 0.05)
Giardia duodenum የጃርዲያ በሽታን የሚያመጣ በሰዎች እና በሌሎች አጥቢ እንስሳት ላይ የታወቀ የአንጀት ጥገኛ ነው።እ.ኤ.አ. በ2004፣ ከ6 ዓመታት በላይ በመስፋፋቱ፣ በተለይም ዝቅተኛ ማህበራዊ ኢኮኖሚያዊ ደረጃ ባላቸው ማህበረሰቦች [32] የተነሳ በአለም ጤና ድርጅት ችላ በተባሉ በሽታዎች ተነሳሽነት ውስጥ ተካቷል።ተፈጥሯዊው የበሽታ መከላከያ ስርዓት ለጂ.የአይጥ ማክሮፋጅስ G. duodenalisን ከሴሉላር ውጭ ወጥመዶችን በመልቀቅ እንደሚገድላቸው ተዘግቧል።ቀደም ሲል ጥናቶቻችን እንዳሳዩት G. duodenalis, ወራሪ ያልሆነ ውጫዊ ተውሳክ, p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 እና NLRP3 የማስታወሻ ምልክቶችን በመዳፊት ማክሮፋጅስ ውስጥ በማንቀሳቀስ የአስተናጋጅ እብጠት ምላሾችን ለመቆጣጠር እና የተለቀቀው GEV ይህንን ሂደት ሊያሻሽል ይችላል.13]፣ 24]።ይሁን እንጂ በ GEV ውስጥ በ NLRP3 ኢንፍላማሶም-የተስተካከለ እብጠት ውስጥ የተካተቱት ትክክለኛ PAMPs እና የ NLRP3 ኢንፍላማሶም በ giardiasis ውስጥ ያለው ሚና ግልጽ ሆኖ ይቆያል።በእነዚህ ሁለት ጥያቄዎች ላይ ብርሃን ለማብራት, ይህንን ጥናት አደረግን.
የ NLRP3 ኢንፍላማሶም በሳይቶፕላዝም በሽታ ተከላካይ ሕዋሳት ውስጥ የሚገኝ ሲሆን እንደ ዩሪክ አሲድ ክሪስታሎች፣ መርዞች፣ ባክቴሪያዎች፣ ቫይረሶች እና ጥገኛ ተውሳኮች ባሉ የተለያዩ ቅንጣቶች ሊነቃ ይችላል።በባክቴሪያ ጥናቶች ውስጥ መርዛማ ንጥረነገሮች ወደ እብጠት እና የሕዋስ ሞት የሚያመሩ ቁልፍ PAMPs ተለይተዋል ።እንደ ሄሞሊሲን ከስታፊሎኮከስ Aureus [35] እና Escherichia coli [36]፣ hemolysin BL (HBL) ከ enterotoxin (NHE) [37] ያሉ አንዳንድ መዋቅራዊ የተለያዩ መርዞች የ NLRP3 እብጠት እንዲነቃቁ ያደርጋሉ።የቫይረስ ጥናቶች እንዳመለከቱት እንደ SARS-COV-2 ኤንቨሎፕ (E) ፕሮቲን [38] እና ዚካ ቫይረስ NS5 ፕሮቲን [39] ያሉ የቫይረስ ፕሮቲኖች በ NLRP3 ተቀባይ የሚታወቁ ጠቃሚ PAMPs ናቸው።በፓራሳይት ጥናቶች ብዙ ጥገኛ ተህዋሲያን እንደ Toxoplasma gondii፣ Trichomonas vaginalis [40]፣ Trypanosoma cruzi [41] እና Leishmania [42] ከመሳሰሉት አስተናጋጅ ኢንፍላማመም አግብር ጋር እንደተገናኙ ተነግሯል።ጥቅጥቅ ያሉ የጥራጥሬ ፕሮቲኖች GRA35፣ GRA42 እና GRA43፣ ከ Toxoplasma gondii ቫይረስ ጋር ተያያዥነት ያላቸው፣ በሉዊስ አይጥ ማክሮፋጅስ [43] ውስጥ ፒሮፕቶሲስ እንዲፈጠር ያስፈልጋል።በተጨማሪም አንዳንድ የሌይሽማንያ ጥናቶች በ NLRP3 ኢንፍላማሶም ውስጥ በተካተቱት ሞለኪውሎች ላይ ያተኮሩ ናቸው፣ ለምሳሌ ጥገኛ ገለፈት ሊፖፎስፎግላይካን [44] ወይም zinc metalloprotease [45]።አኔክሲን ከሚመስለው አልፋ-ጃርዲን የጂን ቤተሰብ መካከል፣ alpha-1 giardin በመዳፊት ሞዴል ውስጥ ከጂ duodenalis መከላከል የሚችል የክትባት እጩ ሆኖ ታይቷል [18].በጥናታችን ውስጥ, G. duodenalis virulence factors alpha-2 እና alpha-7,3 giardinesን መርጠናል, እነዚህም ለጃርዲያ ልዩ ናቸው ነገር ግን በአንጻራዊ ሁኔታ ሲታይ ያነሰ ሪፖርት ተደርጓል.እነዚህ ሁለት ዒላማ ጂኖች ወደ ፒሲዲኤንኤ3.1(+) eukaryotic expression system vector ወደ ኢንፍሉዌንዛ ማንቃትን ለመተንተን ተያይዘዋል።
በእኛ የመዳፊት ሞዴል ውስጥ የተሰነጠቀ የካስፓስ ፍርስራሾች እንደ ኢንፍላማቶሪ ገቢር ጠቋሚዎች ሆነው ያገለግላሉ።በማነቃቂያ ጊዜ፣ NLRP3 ከASC ጋር ይገናኛል፣ ፕሮካሳፓሶችን ይመልሳል፣ እና ፕሮ-IL-1β እና ፕሮ-IL-18ን ወደ አዋቂ IL-1β እና IL-18 በቅደም -18 የሚከፋፍሉ ገባሪ ካሳዎችን ያመነጫል።የሚያቃጥሉ caspases (caspases-1, -4, -5 እና -11) ለተፈጥሮ መከላከያ ወሳኝ የሆኑ እና በእብጠት እና በፕሮግራም የታቀዱ የሕዋስ ሞት ውስጥ የተሳተፈ የሳይስቴይን ፕሮቲሴስ ቤተሰብ ናቸው [46].Caspase-1 የሚንቀሳቀሰው በቀኖናዊ ኢንፍላማሶሞች [47] ሲሆን ካስፓሴስ-4፣ -5 እና -11 የተሰነጠቀው ያልተለመደ ኢንፍላማሶም በሚፈጠርበት ጊዜ [48] ነው።በዚህ ጥናት ውስጥ የአይጥ ፔሪቶናል ማክሮፋጅስን እንደ ሞዴል ተጠቀምን እና p20 caspase-1 cleaved caspase-1 እንደ አስተናጋጅ NLRP3 ብግነት ማግበር በጂ. duodenalis ኢንፌክሽን ጥናት ላይ መርምረናል።ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት በባክቴሪያ እና በቫይረሶች ውስጥ የተካተቱትን ቁልፍ የቫይረስ ሞለኪውሎች ግኝት ጋር የሚጣጣም ብዙ አልፋ-ጃርዲኖች ለተለመደው እብጠት ተጠያቂ ናቸው ።ነገር ግን፣ ጥናታችን የቅድሚያ ስክሪን ብቻ ነው እና ሌሎች ክላሲካል ያልሆኑ ኢንፍላማሶሞችን የሚያነቃቁ ሞለኪውሎችም አሉ፣ ከዚህ በፊት ያደረግነው ጥናት ክላሲካል እና ክላሲካል ያልሆኑ ኢንፍላማሶሞችን በጂ. duodenalis infection [13] እንዳገኘው።የመነጨው p20 caspase-1 ከ NLRP3 ኢንፍላማሶም ጋር የተገናኘ መሆኑን የበለጠ ለማወቅ፣ ቁልፍ የሞለኪውል ፕሮቲን አገላለጽ ደረጃዎችን እና የ ASC oligomerization ደረጃዎችን ለመወሰን አልፋ-2 እና አልፋ-7.3 ጂአርዲንን ወደ መዳፊት ፐርቶናል ማክሮፋጅስ ቀይረናል። የሚያቃጥል NLRP3.ውጤቶቻችን ከ Manko-Prykhoda et al., ከ G. Muris ወይም E.coli EPEC ዝርያዎች ጋር የካኮ-2 ሴሎችን ማበረታታት ብቻ የ NLRP3, ASC እና Caspase-1 የፍሎረሰንት መጠን መጨመር እንደሚችሉ ዘግቧል. ምንም እንኳን ጉልህ ባይሆንም ፣ የጂ ሙሪስ እና ኢ. ኮላይ ወጪ የሶስት ፕሮቲኖችን ደረጃ እንዴት እንደጨመረ [49]።ይህ ልዩነት የጃርዲያ ዝርያዎችን, የሴል መስመሮችን እና የመጀመሪያ ደረጃ ሴሎችን በመምረጥ ልዩነት ምክንያት ሊሆን ይችላል.ለጂ duodenalis የበለጠ ተጋላጭ በሆኑ የ5-ሳምንት ሴት WT C57BL/6 አይጦች ውስጥ MCC950 ን በመጠቀም Vivo assay አድርገናል።MCC950 ቀኖናዊ እና ቀኖናዊ ያልሆነ NLRP3 ን በናኖሞላር ውህዶች የሚያግድ ኃይለኛ እና መራጭ አነስተኛ ሞለኪውል NLRP3 አጋቾች ነው።MCC950 የNLRP3 ማግበርን ይከለክላል ነገር ግን የ AIM2፣ NLRC4 እና NLRP1 ኢንፍላማቶሪ መንገዶችን ወይም የ TLR ምልክት ማድረጊያ መንገዶችን [27] ማንቃት ላይ ለውጥ አያመጣም።MCC950 የNLRP3 ማግበርን ይከለክላል ነገር ግን የNLRP3 ጅምርን፣ K+ effluxን፣ Ca2+ influxን፣ ወይም በNLRP3 እና ASC መካከል ያለውን መስተጋብር አይከለክልም።በምትኩ፣ የ ASC oligomerization [27]ን በማገድ የ NLRP3 ኢንፍላማመም ማግበርን ይከለክላል።ስለዚህ፣ ከጃርዲን መርፌ በኋላ የ NLRP3 ኢንፍላማሶም ሚናን ለመወሰን MCC950ን በ In vivo ጥናት ተጠቅመን ነበር።ገቢር የሆነው caspase-1 p10 ፕሮ-ኢንፍላማቶሪ ሳይቶኪኖችን ፕሮ-IL-1β እና ፕሮ-IL-18ን ወደ አዋቂ IL-1β እና IL-18 [50] ይሰጣቸዋል።በዚህ ጥናት ውስጥ፣ በጃርዲን የታከሙ አይጦች ውስጥ ያለው የሴረም IL-1β ደረጃዎች ከኤምሲሲ950 ጋር ወይም ያለሱ የ NLRP3 ኢንፍላማሶም መነቃቁን እንደ አመላካች ጥቅም ላይ ውለዋል።እንደተጠበቀው, የ MCC950 ህክምና የሴረም IL-1β ደረጃዎችን በእጅጉ ቀንሷል.እነዚህ መረጃዎች G. duodenalis giardin alfa-2 እና giardin alfa-7.3 NLRP3 mouse inflammasome ለማንቃት እንደሚችሉ በግልፅ ያሳያሉ።
ባለፉት አስርት ዓመታት ውስጥ የተጠራቀሙ ጉልህ መረጃዎች IL-17A G. murisን የመከላከል ዋና ተቆጣጣሪ፣ IL-17RA ምልክትን በማነሳሳት፣ ፀረ ተህዋሲያን peptides በማምረት እና የማሟያ ማግበርን በመቆጣጠር [51] መሆኑን አሳይተዋል።ይሁን እንጂ የጃርዲያ ኢንፌክሽን በወጣት ጎልማሶች ላይ በተደጋጋሚ የሚከሰት ሲሆን በወጣት አይጦች ላይ የጃርዲያ ኢንፌክሽን የ IL-17A ምላሽን የማያንቀሳቅሰው የመከላከያ ውጤቱን [52] በመሆኑ ተመራማሪዎች ሌሎች የበሽታ መከላከያዎችን Giardia እንዲፈልጉ ተደርገዋል.የ helminth ኢንፌክሽን ዘዴዎች.በቅርቡ የተደረገ ጥናት አዘጋጆች ጂ ሙሪስ የኤንኤልአርፒ 3 ኢንፍላማሶም በ ኢ. ኮሊ EPEC እንዲነቃ ሊያደርግ ይችላል ይህም ፀረ ተህዋሲያን peptides እንዲመረት የሚያበረታታ እና የመገጣጠም አቅሙን እና በአንጀት ውስጥ የሚገኙትን ትሮፖዞይቶች ብዛት በመቀነስ የኮሎንን ክብደት ለመቀነስ ያስችላል። በ bacilli [49] የተከሰቱ በሽታዎች.የ NLRP3 እብጠት በተለያዩ በሽታዎች እድገት ውስጥ ይሳተፋል.ጥናቶች እንደሚያሳዩት Pseudomonas aeruginosa የሕዋስ ሞትን ለማስወገድ በማክሮፋጅስ ውስጥ ራስን በራስ ማከምን እንደሚያነሳሳ እና ይህ ሂደት በ NLRP3 ኢንፍላማሶም [53] ማግበር ላይ የተመሠረተ ነው።ለN. caninum፣ ምላሽ ሰጪ የኦክስጂን ዝርያዎች-መካከለኛ የ NLRP3 ኢንፍላማሶም ማግበር በአስተናጋጁ ውስጥ ያለውን መባዛት ይገድባል፣ ይህም የሕክምና ዒላማ ያደርገዋል [9]።Paracoccidioides brasiliensis የ NLRP3 ኢንፍላማሶም በመዳፊት አጥንት ቅልጥ-የተመነጨ የዴንደሪቲክ ህዋሶች እንዲነቃ ሆኖ ተገኝቷል፣ በዚህም ምክንያት በአስተናጋጅ መከላከያ ውስጥ ወሳኝ ሚና የሚጫወተው የሳይቶኪን IL-1β እንዲለቀቅ አድርጓል።L. amazonensis፣ L. major፣ L. braziliensis እና L. babytum chagasi ን ጨምሮ በርካታ የሌይሽማንያ ዝርያዎች NLRP3 እና ASC-ጥገኛ caspase-1ን በማክሮፋጅስ ውስጥ እንዲሁም የሌይሻኒያ ኢንፌክሽንን ያንቀሳቅሳሉ።ጥገኛ ማባዛት በNLRP3/ASC/caspase-1 ጂን [11] ውስጥ ባሉ አይጦች እጥረት ተሻሽሏል።ዛምቦኒ እና ሌሎች.የሌይሽማንያ ኢንፌክሽን NLRP3 ኢንፍላማሶም በማክሮፋጅስ ውስጥ ገቢር እንደሚያደርግ ተዘግቧል፣ይህም በሴሉላር ውስጥ ጥገኛ መራባትን ይገድባል።ስለዚህም ሌይሽማኒያ የNLRP3 ማግበርን እንደ የማስወገጃ ስልት ሊከለክል ይችላል።በ Vivo ጥናቶች ውስጥ NLRP3 ኢንፍላማሶም ሌይሽማንያን ለማጥፋት አስተዋፅዖ አድርጓል ነገር ግን በቲሹዎች ላይ ተጽዕኖ አላሳደረም [54].በተቃራኒው፣ በሄልማቲያሲስ ጥናቶች የ NLRP3 ኢንፍላማሶም ማግበር የአስተናጋጁን ከጨጓራና ትራክት ሄልማቲያሲስ [12] የሚከላከለውን የመከላከል አቅም ጨቁኗል።ሽጌላ በአለም አቀፍ ደረጃ ተቅማጥ ከሚያመጡ ዋና ዋና ባክቴሪያዎች አንዱ ነው።እነዚህ ባክቴሪያዎች የ IL-1β ምርትን በP2X7 ተቀባይ መካከለኛ ኬ+ ፈሳሽ፣ ምላሽ ሰጪ የኦክስጂን ዝርያዎች፣ lysosomal acidification እና ሚቶኮንድሪያል ጉዳት ሊያደርሱ ይችላሉ።የ NLRP3 ኢንፍላማሶም phagocytosis እና የማክሮፋጅስ ባክቴሪያቲክ እንቅስቃሴን በ Shigella [55] ላይ አሉታዊ በሆነ መልኩ ይቆጣጠራል።የፕላዝሞዲየም ጥናቶች እንደሚያሳዩት AIM2፣ NLRP3 ወይም Caspase-1 ጉድለት በፕላዝሞዲየም የተያዙ አይጦች ከፍተኛ መጠን ያለው 1 ኢንተርፌሮን ያመነጫሉ እና ከፕላዝሞዲየም ኢንፌክሽን [56] የበለጠ ይቋቋማሉ።ነገር ግን፣ በአይጦች ላይ የ NLRP3 እብጠት በሽታ አምጪ ተህዋስያንን በማነሳሳት የአልፋ-2 ጂአርዲን እና አልፋ-7.3 ጊያርዲን ሚና ግልፅ አይደለም።
በዚህ ጥናት ውስጥ የ NLRP3 ኢንፍላማሶም በ MCC950 መከልከል BW ቀንሷል እና በአይጦች ውስጥ በአንጀት ውስጥ ያሉ ትሮፖዞይቶች ብዛት በመጨመር በ duodenal ቲሹ ላይ የበለጠ ከባድ የፓቶሎጂ ለውጦችን ያስከትላል።አልፋ-2 giardine እና alpha-7.3 giardine አስተናጋጁ መዳፊት NLRP3 ኢንፍላማሜም እንዲሠራ, የመዳፊት የሰውነት ክብደት መጨመር, የአንጀት lavage ፈሳሽ ውስጥ trophozoites ቁጥር ለመቀነስ, እና የፓቶሎጂ duodenal ወርሶታል ለማስታገስ.እነዚህ ውጤቶች እንደሚያሳዩት G. duodenalis የ NLRP3 አስተናጋጅ ኢንፍላማሶም በአልፋ-2 ጃርዲን እና በአልፋ-7,3 giardine በኩል እንዲነቃ ያደርገዋል, ይህም የጂ duodenalis አይጦችን በሽታ አምጪነት ይቀንሳል.
በአጠቃላይ ውጤታችን እንደሚያሳየው alpha-2 እና alpha-7.3 giardines የ NLRP3 አስተናጋጅ ኢንፍላማሶም እንዲነቃቁ እና የ G. duodenalis አይጦችን ኢንፌክሽን ይቀንሳል።ስለዚህ እነዚህ ሞለኪውሎች ጃርዲያሲስን ለመከላከል ተስፋ ሰጭ ዒላማዎች ናቸው።
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS፣ Liang AAM፣ Huang AHC፣ Sergi KM፣ Kam JKMGiardiasis: አጠቃላይ እይታ.ፓት ኢንፍላም ለመድኃኒት አለርጂ እንደሆነ በቅርቡ ተገልጧል።2019፤13፡134–43።
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: የፋርማሲ ሕክምና ግምገማ.የፋርማሲስት ባለሙያ አስተያየት.2007;8፡1885–902 እ.ኤ.አ.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.የጃርዲያሲስ, የመድሃኒት መከላከያ እና አዳዲስ ዒላማዎች መገኘት.የዲስኦርደር መድሃኒት ኢላማዎችን ይጎዳል።2010፤10፡295–302።
Wang Z፣ Zhang X፣ Xiao Yi፣ Zhang W፣ Wu X፣ Qin T፣ ወዘተ. NLRP3 የሚያቃጥሉ እና የሚያቃጥሉ በሽታዎች።ኦክሳይድ ሜድ ሴል Longev.2020፤2020፡4063562።
Chen GY፣ ኑኔዝ ጂ. የኢንፍሉዌንዛ ሚና በአንጀት እብጠት እና በካንሰር።የጨጓራ ህክምና.2011;141፡1986–99።
Pellegrini C፣ Antonioli L፣ Lopez-Castejon G፣ Blandizzi C፣ Fornai M. Canonical and Atypical NLRP3 ኢንፍላማመም ማግበር የበሽታ መቋቋም መቻቻል እና የአንጀት እብጠት መስቀለኛ መንገድ።ቅድመ-መከላከያ.2017፤8፡36።
Li L፣ Wang XC፣ Gong PT፣ Zhang N፣ Zhang X፣ Li S፣ እና ሌሎችም።በ ROS መካከለኛ NLRP3 ኢንፍላማሜም ማግበር ለ N. caninum ኢንፌክሽን ምላሽ ይሰጣል.ጥገኛ ቬክተር.2020፤13፡449።